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Artigo explica a utilização da quimiometria
Autor: MSc. Fabiana A. L. Ribeiro, MSc. Fernando D. Barboza Márcia C. Breitkreitz e Dr. José A. Martins


Quimiometria: inovação no desenvolvimento e validação de métodos analíticos para controle de qualidade na indústria química
 

Quimiometria é o campo da química que utiliza ferramentas estatísticas e matemáticas para o planejamento e otimização das condições experimentais, e para a extração de informação química relevante de dados químicos multivariados. A diferença entre dados univariados e multivariados é que nos primeiros, a análise dos resultados é feita pela observação do comportamento de uma única variável de cada vez, por exemplo, a concentração de uma espécie de interesse ou uma propriedade físico-química (densidade, viscosidade, ponto de fusão, ponto de ebulição). Nos dados multivariados, é possível analisar mais de uma variável simultaneamente, e assim identificar a correlação entre elas. Este tipo de análise permite um entendimento mais completo e sistematizado dos resultados analíticos.
 
Para ilustrar esta diferença, tomemos como exemplo uma das aplicações mais conhecidas na área farmacêutica: a determinação do teor do princípio ativo em formas farmacêuticas por técnicas espectroscópicas aliadas a métodos quimiométricos de calibração multivariada.

Os métodos para controle de qualidade de fármacos se baseiam nas farmacopéias existentes, as quais indicam em sua maioria a utilização de técnicas cromatográficas, em especial a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC, do inglês High Performance Liquid Chromatography). Durante a etapa de desenvolvimento do método, a quantificação do analito é realizada pelo uso de equações matemáticas que correlacionam a sua concentração com o sinal instrumental, que no caso da cromatografia é a área do pico. Neste caso, diz-se que a equação matemática que descreve esta relação é univariada, pois a propriedade que se deseja investigar, a concentração, pode ser descrita por uma única variável, que é o sinal analítico.

No entanto, para que o método seja confiável, é necessário garantir que o sinal analítico seja característico somente da espécie de interesse, ou seja, que ele seja seletivo. Isto requer uma etapa prévia de preparo da amostra, o que no caso da cromatografia é obtido pela escolha adequada das condições do método (coluna cromatográfica, fase móvel, temperatura etc.), tendo como conseqüência o aumento nos custos e no tempo do experimento.

Para contornar o problema da seletividade e permitir a análise na presença de interferentes sem comprometer a eficiência do método, uma alternativa viável e econômica é o uso de métodos espectroscópicos em associação com técnicas quimiométricas. Nestes métodos, modelos matemáticos multivariados correlacionam a concentração do analito com toda a faixa espectral, possibilitando predições estatisticamente confiáveis mesmo na presença de interferentes, desde que estes sejam conhecidos.

O uso destas técnicas permite uma significativa redução no custo, tempo e resíduos gerados, quando comparado às técnicas cromatográficas, pois as análises são rápidas e requerem pouco ou nenhum preparo de amostras. A Tabela 1 apresenta os números desta economia para 3 produtos farmacêuticos, cujas estimativas foram realizadas levando-se em consideração os procedimentos para a análise dos padrões e amostras: custos com reagentes, acessórios, analista, contrato de manutenção do equipamento e tempo gasto com os procedimentos analíticos e cálculos matemáticos.

Apesar das vantagens apresentadas, estas novas metodologias são dependentes de uma técnica de referência, em geral HPLC, durante a etapa de desenvolvimento do método e ao longo da sua utilização. Sua performance deve ser testada periodicamente, o que é feito pela comparação estatística com a técnica de referência. Por este motivo, as técnicas multivariadas são utilizadas sempre como técnicas alternativas, e podem ser consideradas grandes aliadas às técnicas cromatográficas, com o intuito de reduzir o tempo e o custo dos experimentos.

Tabela 1
: Comparação do custo, tempo de análise e quantidade de resíduos gerados por análise, para os métodos univariados e multivariados.

Produto
Método de Referência Univariado: HPLC
Método Alternativo Multivariado: Espectroscopia NIR ou UV/Vis
 
Tempo (min)
Custos (R$)
Resíduos (mL)
Tempo (min)
Custos (R$)
Resíduos (mL)
Amoxicilina(1) suspensão oral
210
15.02
450
70
11.73
360
Cefaclor(2) cápsulas
269
24.79
470
50
8.73
240
Cloridrato de Fluoxetina(3) comprimidos
210
64.12
2350
20
2.06
0(3)

(1)
método alternativo: UV/Vis; (2) método alternativo: UV/Vis; (3) método alternativo: NIR. Neste último caso, a análise é realizada no comprimido intacto, não necessitando de preparo da amostra.

Na Indústria Química em geral, a associação de ferramentas quimiométricas com técnicas instrumentais (espectroscopia NIR, UV/Vis, Vis/NIR, GC, HPLC, fluorescência de Raio-X, DSC) são empregadas no desenvolvimento de métodos analíticos para controle de qualidade, qualificação de matéria prima e controle de processos. No Brasil, o seu avanço ainda é tímido, e as principais áreas que empregam estes métodos são as Indústrias de Alimentos, Papel e Celulose, Petróleo, e mais recentemente, a Indústria Farmacêutica, mas o seu potencial se estende a todas as áreas da Química. Os principais métodos quimiométricos são: reconhecimento de padrões (também conhecidos como métodos de classificação), calibração multivariada e planejamento e otimização de experimentos. Os métodos de calibração multivariada já foram apresentados acima, com os exemplos da área farmacêutica. A seguir será apresentada uma breve descrição dos outros dois tipos de métodos, acompanhados de estudos de casos da área farmacêutica.

Reconhecimento de Padrões
- Os Métodos de Classificação, ou Reconhecimento de Padrões, são utilizados para agrupar amostras em categorias segundo suas similaridades, e têm sido amplamente utilizados para identificação e qualificação de matéria prima, investigação de falhas de processo, monitoramento e controle de processos, avaliação de fontes de contaminação em estudos ambientais, e em estudos de formulação e avaliação sensorial de alimentos, bebidas e cosméticos. Estes métodos permitem a construção de modelos de classificação, no qual as informações das amostras tais como o sinal analítico instrumental, a formulação ou características físico-químicas, podem ser associadas a atributos pré-definidos, como classes (atividade biológica de potenciais a fármacos, aceitação num painel sensorial, conformidade, parâmetros de qualidade etc.). Uma vez validados, estes modelos são utilizados para classificar novas amostras.

A figura abaixo (1)
apresenta o dendograma obtido durante a análise hierárquica de agrupamentos (HCA, Hierarchical Cluster Analysis), uma das técnicas de classificação mais simples, para espectros NIR obtidos de amostras de uma matéria prima pré-formulada de duas classes: CONFORME e NÃO CONFORME. Este tipo de matéria prima é utilizado na produção de medicamentos e consiste em uma mistura do princípio ativo e alguns excipientes em concentrações específicas, e variações nestas concentrações poderão impactar a qualidade do produto final. Estas variações podem ser detectadas por espectroscopia NIR, e a discriminação quantitativa das duas classes pode ser obtida com o uso do método HCA. Esta discriminação é realizada com base na similaridade entre os espectros, estimada a partir da distância euclidiana multidimensional entre os diversos comprimentos de onda da faixa espectral. O resultado é o dendograma apresentado na Figura 1, que mostra claramente a separação das duas classes de amostras. 
 

Figura 1: Dendograma da Análise Hierárquica de Agrupamentos (HCA) para estudos de não conformidade.

A conformidade das amostras pode ser estimada por meio de testes de dissolução no produto final fabricado com as matérias primas em estudo. Por meio da construção de modelos de classificação com amostras cuja conformidade é previamente conhecida, é possível posteriormente estimar a conformidade de novas amostras sem que seja necessário realizar o teste de dissolução, o que reduzirá o custo do teste e o tempo para liberar a matéria prima.

O uso de outras técnicas quimiométricas para analisar os espectros, tais como análise de componentes principais (PCA, Principal Component Analysis) ou regressão por mínimos quadrados parciais (PLS, Partial Least Squares) permitem ainda identificar a fonte da variabilidade dos resultados que causam a não conformidade. Este é um exemplo simples de como a quimiometria pode auxiliar na redução de custos e tempo durante a etapa de qualificação de matérias primas.

Planejamento experimental - Técnicas de planejamento experimental permitem alterar, de forma simultânea e sistemática, todas as variáveis relevantes envolvidas no processo ou no desenvolvimento de um produto, de tal maneira que a influência de cada variável possa ser estimada de forma precisa. A relação entre as variáveis envolvidas e a resposta ou propriedades do sistema (produto ou processo) é então descrita através de modelos matemáticos que fornecem ao investigador um completo entendimento de seu domínio experimental e com um número mínimo de experimentos, permitindo a rápida tomada de decisões e evitando gastos desnecessários com novos experimentos. Cabe ressaltar que métodos multivariados permitem estimar interações entre fatores, o que não é possível ser avaliado através de métodos univariados.

Para ilustrar a aplicação deste tipo de método, foi selecionado um estudo de caso do desenvolvimento de uma solução oral contendo o princípio ativo e excipientes, no qual apenas a concentração do ativo é conhecida. O problema neste caso consiste em encontrar a proporção entre dois excipientes, Sorbitol e Glicerina, que forneça valores específicos de pH e densidade, duas propriedades que influenciam fortemente a qualidade do produto final e a aceitação deste pelo consumidor. Pelo método univariado, esta busca é realizada mudando a concentração de um excipiente de cada vez, e mantendo a do outro fixa, até que os valores desejados de pH e da densidade sejam encontrados. Um formulador experiente saberá as combinações com maior probabilidade de sucesso, mas mesmo assim, terá que produzir diversas misturas-piloto até encontrar aquela que forneça as propriedades desejadas. Utilizando métodos multivariados, é possível planejar um número mínimo de experimentos, e por meio de modelos matemáticos que correlacionam a proporção entre os fatores (sorbitol e glicerina) e as propriedades investigadas (pH e densidade), efetuar predições das concentrações necessárias para atingir os valores desejados destas propriedades. A Figura 2 apresenta os mapas de contorno para os modelos matemáticos utilizados, que foram construídos com apenas cinco pilotos.
 

Figura 2: Superfícies de resposta do planejamento experimental. Legenda: Composição dos pilotos utilizados na construção do modelo (em vermelho); Composição alvo predita (em azul).

Vantagens - A associação de técnicas instrumentais e métodos quimiométricos permite que os resultados analíticos sejam obtidos de forma sistemática e com confiabilidade estatística, permitindo reduzir o custo e o tempo dos experimentos, além de diminuir a emissão de resíduos. Através desta associação pode-se monitorar propriedades críticas durante o processo de fabricação, de modo a minimizar o risco sobre perdas de lotes, otimizando, assim, as operações de produção, propiciando às empresas aumentar sua competitividade e, também, acelerar o desenvolvimento e lançamento de novos produtos no mercado.

Para saber mais - Aplicações detalhadas dos métodos quimiométricos em outras áreas podem ser encontradas na internet, nos endereços http://www.infometrix.com/apps/apps.html (Infometrix) e http://www.statease.com/articles.html (Design Expert). Informações sobre aspectos regulatórios do uso destas técnicas em associação com métodos espectroscópicos são descritos na norma ASTM E1655-00 (Annual Book of ASTM Standards, E1655-00: Standard Practices for Infrared Multivariate Quantitative Analysis, American Society for Testing and Materials International, PA, 2000), e na Farmacopéia Americana (United State Pharmacopoeia USP30NF25, 2007, Chap. 1119 and 1120).

Os autores

Graduados em Química por universidades paulistas de referência (Unesp e Unicamp) e com títulos de mestres e/ou doutores, os autores integram o Instituto Internacional de Pesquisas Farmacêuticas. Contatos poderão ser feitos pelo e-mail iipf@institutoipf.org.b r ou pelo site www.institutoipf.org.br




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